在这里，SonjaK.Schmidt团队目标是评估两种不同转移来源的黑色素瘤细胞系使用不同的商业可获得的基质的可打印性，这些基质被认为可以广泛用于3D生物打印应用。研究团队首次为黑色素瘤细胞在不同材料(包括Matrigel)中的3D生物打印提供了概念证明，并指出了使用独立于应用程序的生物墨水的可能性和局限性。实验表明，3D打印构建物中细胞的增殖和形态取决于细胞系和材料组成，而在案例中，用RGD序列或层粘连蛋白混合物修饰墨水并不会导致细胞差异。
研究使用五种不同的生物墨水来分析细胞反应、肿瘤细胞的形态和表型。Cellinks由海藻酸盐和纳米纤维纤维素组成，其中一种进一步与RGD-肽(CelLinkRGD)偶联。GelXA生物墨水由甲基丙烯酸明胶、*原胶和海藻酸盐组成，另一种则进一步与层粘连蛋白(GelXALaminink+)偶联。之所以选择这些修饰，是因为整合素类合适受体蛋白的表达在恶性黑色素瘤中得到了很好的描述，并被发现对肿瘤的生长和进展具有重要作用。Matrigel类似于细胞外基质，由IV型胶原、层粘连蛋白、牙本质蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和生长因子组成。在这里，我们的目的是比较自然衍生的复杂基质和人工生产的生物墨水，并确定偶联ECM-多肽对生物墨水细胞行为的影响。研究团队打印了两种来自黑色素瘤转移瘤的不同荧光细胞系(MelImGFP，GFP；MV3dc，核H2BEGFP和DsRed2；打印参数如表1所示)。研究团队必须根据不同的生物墨水使用不同的打印压力，但所有五种材料都是可打印的(图1A)。在培养过程中，这两种细胞都没有表现出任何宏观上可见的变化。GelXA-Inks在肿胀的基础上表现出一些微小的变化，而Matrigel无法保持网格结构，在14天的培养期间，主要基于细胞增殖而显示出较高的体积增加(图1A)。在所有结构中，打印后一天细胞均匀分布(图1B)。在14天的培养时间里，没有观察到细胞下沉，但细胞在多个层次的结构上分布良好。
图1.生物墨水的可印刷性和细胞分布。用CelLink+生物打印机分别用CelLink生物墨水、CelLinkRGD、GelXA、GelXALaminink+或Matrigel打印面积为1cm2、三层高、含个细胞/毫升的构建体。(A)时间点d0、d7和d14处的细胞加载3D打印构件的代表性宏观图像。(B)3D打印后1天，黑色素瘤细胞系MelImGFP(绿色)和MV3dc(红色/绿色)在各自墨水中的代表性荧光显微镜图像。比例尺表示μm。
众所周知，在3D打印过程中，由各自生物墨水的粘度引起的剪切力是细胞的一个关键因素。然而，显微镜图像显示荧光信号，代表3D打印过程后的活细胞(图2A)。如上所述，分析了第一天的细胞数量(图2B)。与能够很好地应对印刷过程的GelXA-墨水相比，在基于海藻酸盐的细胞墨水中，MelImGFP的活细胞数量显著减少(p≤0.05)。在Cellinks中可以检测到许多存活的MV3dc细胞，在GelXA中有较高的活细胞率。与未经修饰的墨水相比，GelXALaminink+中的MV3dc活细胞数量减少了约三分之二。在两种细胞系中，Matrigel细胞数最多(p≤0.05)。图2.黑色素瘤细胞在生物墨水中的存活情况。(A)3D打印后一天，每个细胞系MelImGFP和MV3dc的两张具有代表性的荧光显微镜图像。这两个黑色素瘤细胞株都在所有生物墨水中的生物打印和交联过程中存活下来。刻度条代表μm。(B)在MelImGFP当天对生物墨水中每毫米活细胞的定量显示，两种基于CelLink的墨水中的活细胞数量都很低，而在基于GelXA的墨水中活细胞的比例更高，并显示Matrigel中的活细胞数量显著最高。MV3dc显示在所有材料中都有适当数量的活细胞，其中Cellinks和GelXALaminink+的活细胞数量最少，Matrigel的活细胞数量最高。*p≤0.05由于所用的五种基质为细胞提供了不同的黏附线索，研究团队预计黑色素瘤细胞会在材料中形成不同的形状。有趣的是，绝大多数单细胞在材料中保持圆形，只有一小部分细胞在限定的生物墨水中扩散(图3A)。对打印后第1、2、4天的突起长度进行了分析，因为从那时起细胞开始增殖，不再能确定单细胞的扩散情况(图3B)。图3.不同生物墨水中黑色素瘤细胞的形态
在所有五种测试的生物墨水中，在MV3细胞中观察到的YAP/TAZ活性都很低(图3C)。在七天的培养过程中，只有极少数单个细胞在细胞连接中显示出荧光信号。在都含有整合素结合基序的GelXA生物墨水和Matrigel中，我们检测到更多的细胞传递绿色荧光蛋白信号。然而，无论是RGD偶联基质中的细胞，还是与层粘连蛋白偶联的GelXA中的细胞，与各自未修饰的生物材料中的细胞相比，荧光细胞的数量都没有增加。由于MelImGFP和MV3dc被证明在生物打印过程中幸存下来，我们分析了不同生物墨水中细胞随时间的增殖情况。与Matrigel、基于海藻酸盐(CelLink)和基于明胶甲基丙烯酸酯(GelXA)的生物墨水相比，随着时间的推移，细胞表现出明显的增殖行为(图4A，B)。图4.培养14天后，肿瘤细胞在生物墨水中的增殖。(A)典型的荧光图像，显示在用CelLink生物墨水、CelLinkRGD、GelXA、GelXALaminink+和Matrigel打印后，MelImGFP和MV3dc在d4、d7和d14的增殖。MelImGFP和MV3dc在CelLinkBioink和CelLinkRGD中几乎没有生长或增殖，但在GelXA和GelXALaminink+中形成了不规则的团簇。在Matrigel中，细胞增殖迅速，MelImGFP成簇生长，随时间融合在一起，而MV3dc细胞在整个材料中形成密集的链状网络。标尺表示微米。(B)通过测定每个时间点至少三个荧光图像的平均灰度值强度来量化增殖，以对数绘制以强调Matrigel中两种细胞的最强增殖。经统计比较，第14天Matrigel的平均灰度值与当天其他材料的平均灰度值有显著差异。在比较第4天或第7天时也观察到了同样的意义。总而言之，研究团队实验揭示了两个黑色素瘤细胞株在四种商业生物墨水和Matrigel中的可印刷性。这两种细胞株在印刷过程和随后的两周培养中都存活了下来，根据基本材料成分的不同，表现出不同的增殖和扩散行为。与研究团队的预期相反，细胞存活、形态和增殖并没有从RGD或层粘连蛋白的材料修饰中受益。在相同的环境条件下，观察到两种黑色素瘤细胞系在细胞存活、形态和增殖方面的差异，说明了开发合适的生物墨水的困难。研究团队结论是，3D生物打印需要精确了解打印过程中的细胞和材料属性、细胞与材料的相互作用以及细胞和材料的行为，以便在开始开发有效的3D模型甚至组织之前，找出如何根据某些线索控制某些细胞。进一步研究嵌入在结构中的细胞中发生的分子信号转导将是非常有意义的，以便定义参与信号转导的分子，从而更接近于能够控制和操纵定义的3D结构中的细胞反应。如需原文，请在下方留言预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇